细胞自噬可能是相关行业人士都值得关注的知识，在此币圈网对细胞自噬会不会导致细胞死亡进行详细的介绍，并拓展一些相关的知识分享给大家，希望能够为您带来帮助！

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细胞自噬

自噬（autophagy）被认为是维持细胞稳态的关键过程，也是对等压力源的反应，如营养缺乏，这可能会危及细胞的生存。当细胞接触到这些压力源时，原本在低水平发生以平衡生物分子的恒定合成的自噬，就会被大幅度上调。 这种上调会增加了细胞的吸收和降解，将大分子释放回胞质中以驱动必须的代谢反应并产生能量。

在正常和压力条件下，自噬对细胞健康的贡献，意味着这种严格调控和精确协调过程的重要生理和病理作用。事实上， 自噬在哺乳动物的发育过程中被发现是有用的。 此外，最近的研究发现自噬是各种疾病和病症的重要调节器。探索自噬在发育和疾病中的参与，对于更全面地了解这一途径的作用至关重要，并且可能对保持健康或治疗疾病有影响。

自噬的研究已经成为如今医学研究的常客，发文量也十分巨大，成为常规生物学现象来研究，但是有一些实验上的技巧值得探讨一二，例如一些试剂的使用等等

1、自噬相关试剂的使用。

①MDC: 取12 mg粉末溶于720 nl DMSO使其浓度为50 mmol/L,分装后-20冰箱保存。临用前用MEM稀释到终浓度50 umol/L;

②Rapamycin: 用MEM培养基配成终浓度为1 umol/L,现用现配;

400ng/ml喹乙醇:称取4 mg喹乙醇,DMSO预溶(体积0.1%)后加入10 ml MEM培养液至完全溶解,现用现配,避光保存;

③3-MA: 首先用PBS溶解粉末,临用前加热至完全溶解后再加入MEM培养基至终浓度10mmol/L;PI3K抑制剂（3-MA，Wortmannin）可干扰或阻断自噬体的形成；

用RAPAMYCIN诱导自噬我也查过一部分文献，有用无血清的，也有用，一般培养基的，浓度从25nM到100nM都有，用的是50nM的雷帕霉素，加入一般的培养基中，目的是排除无血清所诱导出来的自噬。

文献说饥饿初期激活的是大分子自噬，在4-6小时活力达到最大，24h后以CMA途径为主

④Earle's balanced salts solution (EBSS) for 48 h

sigma的EBSS，货号E2888，有碳酸氢钠，有酚红的，酚红到不是很必须，只是一个PH指示作用，好看些

⑤无血清诱导自噬：EBSS 诱导6个小时就可以了。

EBSS一定可以诱导出来，只是需要说明的是时间点的设置，因为从饥饿诱导开始半个小时就可能开始自噬了，一直到24小时都持续，所以应该设置不同的时间点观察这个作用。另外一个很大的问题是，饥饿诱导的一个很大的弊端是细胞死亡，这也是我面临的问题，就是在细胞收养的时候蛋白浓度太小了。24小时就很少了，更不要说48小时和72小时了。

⑥Hank's诱导，也就是通常所说的饥饿诱导，细胞培养到对数生长期后以Hank's替代常规完全培养基，3h后就可诱导出自噬。我用Hank's诱导了3h后电镜观察有30%细胞都有自噬这种现象，但不如国外报道的高。

⑦sigma的氯喹的货号C6628。用氯喹做自噬抑制剂，293T细胞50uM就可以。1. 可以用双蒸水配制2. 配制后4度保存

不同的自噬抑制剂机制不同。抑制的步骤也不同。有的不能抑制lc3的剪切，但能抑制后续的步骤，Chloroquine抑制自噬体与溶酶体的融合过程，autophgy不能完成，所以lc3才会累积。因此加了抑制剂lc3之后会比不加的要高。氯喹能提高溶酶体中的pH值，使溶酶体中的酸性水解酶丧失活性，从而导致“自噬溶酶体”不能降解，因此，位于自噬体和自噬溶酶体膜上的LC3不能按时降解，表现为LC3荧光长时间的保留或WB中LC3条带变粗。

⑧Z-VAD-FMK（caspase-3 抑制剂）抑制EV71感染所引起的细胞凋亡，观察细胞的自噬情况。研究发现，抑制细胞凋亡能增加LC3-I转化为LC3-II以及p62的降解。

1. 雷帕霉素：作为以mTOR 为靶点最经典的诱导剂已经被广为应用，推荐工作浓度为1μmol-10μmol；

2. 氯喹：氯喹（Chloroquine）作为溶酶体的抑制剂，可以抑制自噬体与溶酶体的融合从而可以用来作为自噬以及自噬流的抑制剂用于实验研究，推荐使用浓度：10umol-50umol。

2、自噬诱导剂

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的药物有：

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激

(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）

(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂

(5) Rapamycin：mTOR抑制剂

(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂

3、自噬抑制剂

(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K）hVps34 抑制剂

(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂

(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）

衣霉素(tunicamycin from Slreptomyces sp., TM). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:T7765 ;溶于DMSO中配成储存液,使用时DMSO终体积浓度不超过1/1000。

3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA). Sigma-Aldrich 公司产品,货号:M9281;溶于灭菌超纯水制成储存液。

氯喹二磷酸盐(chloroquine diphosphate salt,CQ) sigma-Aldrich 公司产品,货号:C6628;溶于灭菌超纯水中制成存液。

雷帕霉素(rapamycin), 2.5mg/ml in DMSO, Sigma-Aldrich 公司产品,货号:R8781;

4、MDC染色焚光显微镜检测细胞自睡

单丹黄酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是一种突光染料,被用作自吞泡的示踪剂。具体操作步骤如下:

(1)将处于对数生长期的HepG2细胞按常规方法消化后接种于6孔板,每孔接种1x106个细胞;

(2)细胞密度达到60%-70%时,弃去培养液,小心用PBS洗1遍,分别用含TG浓度为0、0.5、1 nM的培养基及含Rapamycin (终浓度1 pM)的培养基继续培养24 h;

(3)弃上清PBS洗2遍,每孔加入含MDC(终浓度50 nM)的培养基于37 V、5% CCh的恒温培养箱中避光温育20 min;

(4)取出六孔板置于劳光显微镜下,Ih内观察细胞自唾发生情况并拍照。

5、流式细胞术检测细胞自噬发生率

(1)取对数生长期的HepG2细胞,接种于6孔板,培养24h之后,分别用含TG浓度为0、1、2、4、8uM的培养基继续培养24h和0.5uM的TG作用不同时间(0、24、36、48、60h)后,取出六孔板,将上清收集到4 ml的离心管中;

(2)每孔加入2ml含MDC(终浓度50nM)的MEM培养基,于37°C、5%0?的恒温培养箱中避光孵育30 min;

(3)将收集的上清2000rpm,离心5min;

(4)弃掉上清,每管加入500ul含MDC(终浓度50 uM)的MEM培养基,吹打混句,37 °C避光解育30 min;

(5)取出六孔板,PBS洗2次,0.25%的胰酶消化2min, 1 ml的PBS吹打混匀收集到1.5ml的离心管中,2000 rpm.离心5 min;

(6)弃掉上清,加1ml的PBS重悬,2000rpm,离心5 min;

(7)吸出800ul上清,剩余的200 ul吹打混勾;

(8)鲜育完的上清,2000rpm,离心5 min;

(9)弃掉上清,1ml的PBS吹打混勾收集到1.5 ml的离心管中,2000 rpm,离心5 min;

(10)重复步骤(6)和(7);

(11)将上述两个相同浓度或相同时间点的两管混勾,过300目铜网上机检测。流式细胞

仪以488nm激发波长测定MDC染色的荧光强度。

LC3B WB: 1:2000

条件是15% SDS-PAGE, 正常跑胶至下沿0.5cm即可，200mA 湿转45min 正常0.45的PVDF，5%牛奶封闭1h，4C过夜摇动孵育，洗抗体3*5min即可

LC3B的Western-blot检测，配置的15%的分离胶，湿转250mA，60min

转自科研者言公众号

基金知识##细胞自噬的相关实验和方法，对实验很有用

简述细胞自噬过程

定义

细胞自噬是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程.该过程中一些损坏的蛋白或细胞器被双层膜结构的自噬小泡包裹后送入溶酶体(动物）或液泡（酵母和植物 ）中进行降解并得以循环利用.

编辑本段

形式

细胞自噬主要有两种形式：微自噬（microautophagy)和巨自噬（macroautophagy）.

微自噬

定义：指溶酶体或者液泡内膜直接内陷将底物包裹并降解的过程.

作用时间：多在种子成熟时储藏蛋白的沉积或萌发时储存蛋白的降解中起作用.

巨自噬

定义：在其过程中,底物蛋白将一种双层膜的结构包裹后形成直径约400~900纳米大小的自噬小泡（autophagosome),接着自噬小泡的外膜与溶酶体膜或者液泡膜融合,释放包裹底物蛋白的泡状结构到溶酶体或者液泡中,并最终在一系列水解酶的作用下将其降解,我们将这种进入溶酶体或者液泡腔中的泡状结构称为自噬小体.

作用时间：营养缺乏条件下培养的细胞、植物的免疫反应、叶片衰老及环境胁迫应答.

什么是细胞自噬？

自噬是指细胞分解细胞质等自身构成成分的现象。自噬作用是细胞加速新陈代谢，或者在饥饿时获得能量的一个重要手段。自噬在各种生命活动中发挥着重要作用，比如它可以加速细胞内的新陈代谢，或者在细胞处于饥饿状态时从分解产物中获得能量。自噬过程中，细胞需要一个特殊的“口袋”将有待分解的物质包围并隔离起来，这个叫做自噬体的“口袋”由双层脂质膜构成，但它的形成机制一直是个谜。日本科学家最近研究发现，原来是一种名为“Atg8”的蛋白质在自噬体形成过程中发挥着作用。研究人员发现，“Atg8”和一种磷脂分子结合后，就可以黏合脂质膜，进而形成自噬体。在使用酵母进行的实验中，如果彻底破坏“Atg8”的功能，酵母细胞内就不能形成自噬体，而如果“Atg8”的部分功能受损，酵母细胞形成的自噬体明显比正常细胞的自噬体小。

细胞自噬（autophagy）

细胞自噬（autophagy）的过程（以下有视频讲解）

1）细胞接受自噬诱导信号后，在胞浆的某处形成一个小的类似"脂质体"样的膜结构，然后不断扩张，被称为Phagophore。

2）Phagophore不断延伸，将胞浆中的任何成分，全部揽入，然后"收口"，成为密闭的球状的autophagosome，即"自噬体"。

3）自噬体形成后，可与细胞内吞的吞噬泡、吞饮泡和内体融合（这种情况不是必然要发生的）。

4）自噬体与溶酶体融合形成autolysosome，期间自噬体的内膜被溶酶体酶降解，2者的内容物合为一体，自噬体中的"货物"也被降解，产物（氨基酸、脂肪酸等）被输送到胞浆中，供细胞重新利用，而残渣或被排出细胞外或滞留在胞浆中。

来自浙江大学团队的视频讲解

细胞自噬和多种疾病发生发展有关系

正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有：

**一、自噬诱导剂 **

(1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激

(2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶）

(3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿

(4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂

(5) Rapamycin：mTOR抑制剂

(6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂

**二、自噬抑制剂 **

(1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂

(2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂

(3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂）

除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。

三、自噬过程进行观察和检测 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有：

1、观察自噬体的形成

由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV）

2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成

由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。

3、利用Western Blot检测LC3-II/I比值的变化以评价自噬形成

自噬形成时，胞浆型LC3（即LC3-I）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估计自噬水平的高低。

（注意：LC3抗体对LC3-II有更高的亲和力，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。）

4、检测长寿蛋白的批量降解：非特异

5、MDC（Monodansylcadaverine，单丹磺酰尸胺）染色：包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。

6、CellTrackerTM Green染色：主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。

四、自噬相关蛋白的定位 在研究自噬相关蛋白时，需对其进行定位。

由于自噬体与溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体关系密切，为了区别，常用到一些示踪蛋白在荧光显微镜下来共定位：

Lamp-2：溶酶体膜蛋白，可用于监测自噬体与溶酶体融合。

LysoTrackerTM 探针：有红或蓝色可选，显示所有酸性液泡。

pDsRed2-mito：载体，转染后表达一个融合蛋白（红色荧光蛋白+线粒体基质定位信号），可用来检测线粒体被自噬掉的程度（Mitophagy）。

MitoTraker探针：特异性显示活的线粒体，荧光在经过固定后还能保留。

Hsp60：定位与线粒体基质，细胞死亡时不会被释放。

Calreticulin（钙网织蛋白）：内质网腔

（注意：这些蛋白均为胞浆蛋白，爬片或胰酶消化的细胞在做免疫荧光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS处理。）

经过以上对细胞自噬的分享介绍，相信你对细胞自噬会不会导致细胞死亡有了大概的了解，想知道更多关于细胞自噬的知识，关注币圈网，我们将持续为您分享！